本研究设计、合成了一系列VEGFR-2抑制剂，并评估了它们对肝癌细胞（HepG-2细胞系）的抗增殖活性。发现化合物29b（IC50 = 4.33 ± 0.2 g/ml）比阿霉素（IC50 = 4.50 ± 0.2 g/ml）表现出更强的抗增殖活性，并且是索拉非尼活性的78%。化合物29b、29c和29a对VEGFR-2表现出有效抑制活性，IC50 值分别为3.1 ± 0.04、3.4 ± 0.05和3.7 ± 0.06 µM时。此外，化合物29b诱导细胞凋亡并阻滞细胞周期为G2/M期。为研究目标化合物与VEGFR-2的作用机制（PDB ID：2OH4），使用BIOVIA Discovery Studio软件借用分子对接来分析化合物与VEGFR-2活性位点的可能相互作用。并对活性较好候选物进行进一步的结构优化，用于获得新的先导化合物，以寻找强效、选择性的抗肿瘤药物。
分子对接(Molecular docking)是基于结构药物设计的核心模拟手段，依据受体与配体作用时的几何匹配和能量匹配过程，模拟受体-配体相互作用，预测两者间最佳的结合模式和结合亲和力。采用分子对接模拟技术，科研人员可以进行基于结构的药物虚拟筛选，药物分子的结构改造，配体和受体相互作用的机理研究等工作，从而大大提高实验效率。在BIOVIA Discovery Studio这一分子模拟的综合平台中，分子对接程序包含Libdock、CDOCKER、Flexible Docking，这三种对接算法各有优势，能够满足广大科研工作者的多种应用需求，为其提供配体受体间相互识别的“利器”。
Ref：Bioorganic Chemistry. Accepted 3 December 2020, IF=5.275
链接：https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2020.104532
一. 研究背景
肝癌(HCC)是一个全球性的健康问题，被认为是最顽固的肝脏恶性肿瘤。细胞内信号通路缺陷导致细胞增殖和凋亡异常是HCC发生的关键机制之一。肿瘤的发展和生长包括几个复杂的细胞信号通路，这些通路包括几种蛋白质，如血管内皮生长因子（VEGF）和VEGF受体（VEGFR）。EGFR-2的过表达是许多肿瘤（包括HCC）中可检测到的迹象。众所周知，为了获得持续生长和转移性扩张所需的营养，所有活动性肿瘤都必须经历新的血管形成或血管生成。VEGF诱导和血管生成由环境因素引起，例如缺氧或遗传修饰，包括致癌酪氨酸激酶的激活。血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）是一种酪氨酸激酶亚型，在血管内皮细胞中表达并响应VEGF结合信号，导致内皮增殖和迁移。在健康组织中观察到VEGFR-2的低表达，而在包括肝细胞癌在内的不同癌症类型中过表达。因此，VEGFR-2已被确定为生产新型抗癌药物的极好治疗靶点。
酪氨酸激酶抑制剂（TKI）是一种小分子，可在受体的结合位点与ATP竞争。VEGFR-2抑制剂作为一种TKI，可阻止血管生成和淋巴管生成的重要过程。VEGFR-2抑制剂分为三个亚型。I型抑制剂，称为ATP竞争性抑制剂，通过1-3氢键与ATP腺嘌呤环所容纳的区域结合。II型抑制剂，抑制激酶的非活性构象，防止其激活。这类激酶抑制剂用ATP结合裂缝和紧邻的疏水袋。III型抑制剂是共价抑制剂，可与半胱氨酸残基共价结合并阻止ATP在结合位点的结合。在这些临床使用的VEGFR-2抑制剂的骨架中，那些含有喹唑啉部分的核心可以与VEGFR-2的ATP结合口袋相互作用。此外，我们研究组设计合成的化合物10对VEGFR-2显示出高活性，IC50值为2.5 µM，几乎与索拉非尼相当（IC50 = 2.4 µM）。基于我们之前的研究以及酪氨酸激酶作为设计新抗癌药物的靶点的重要性，因此引入对VEGFR-2-TK具有抑制活性的新型4-(3H)-喹唑啉酮衍生物。发现化合物29b具有较好的抗癌活性，为研究其与VEGFR-2激酶的结合模式，我们通过分子对接研究其相对结合亲合力以及与激酶活性位点的结合相互作用。
二. 研究过程
在这项研究中。首先，我们结合对VEGFR-2结合口袋的分析，通过喹唑啉与有效抗肿瘤部分的分子杂交设计合成了一系列新型喹唑啉衍生物。然后，对这一系列化合物进行了HepG2细胞上的体外抗增殖活性和体外VEGFR-2酪氨酸激酶测定。结果显示，大多数测试化合物会干扰VEGFR-2活性，IC50值范围为3.1-37.4 µM。其中，化合物29b、29c和29a对VEGFR-2表现出较好的抑制活性，IC50值分别为3.1、3.4和3.7 µM。接着，通过机制研究发现化合物29b阻滞细胞周期为G2/M和pre-G1期和诱导细胞凋亡，并通过体内抗肿瘤活性实验发现9b在体内具有显著的抑制肿瘤生长作用。
为进一步研究化合物与VEGFR-2激酶活性位点的结合相互作用和相对结合亲和力，先通过借用BIOVIA Discovery Studio中CDOCKER进行了分子对接，并计算了化合物与VEGFR-2的结合能。通过结合模式图，我们发现目标化合物都占据了VEGFR-2活性位点的相同口袋，化合物29b、29c和29a与索拉非尼的酶活性位点几乎相同，但其与VEGFR-2结合亲和力高于索拉非尼（表1）。
表1 化合物与VEGFR-2的结合自由能
对接结果可以为进一步的结构修改提供指导。29b与VEGFR-2的结合模式表明，磺酰硫脲部分的两个NH基团与Glu883的羧酸盐形成了两个氢键（1.58 & 2.83 Å），而氧原子与Asp1044形成氢键作用（2.59 Å）。喹唑啉部分与Phe916形成相互作用。而中心苯基与Lys866形成阳离子pi键作用（图1 b）。
图1 索拉菲尼(a)和化合物29b (b)、29c (c)、29a (d)与VEGFR-2的结合模式
此外，化合物29c的结合模式表明，磺酰硫脲部分的两个-NH基团与Glu883的羧酸盐形成了两个氢键（1.28 & 2.26 Å），而氨磺酰基的氧原子Asp1044形成氢键作用。喹唑啉部分与Phe916和Leu838形成三个相互作用。中心苯基部分与Lys866形成阳离子pi键（图1 c）。最后，化合物29a的结合模式表明，磺酰硫脲部分的两个NH基团作为Glu883的羧酸盐形成了两个氢键（1.42 & 1.45 Å），而氨磺酰基的氧原子与Asp1044的NH形成氢键，与Lys886形成额外的两个氢键。此外，该化合物与蛋白形成了四个芳烃-H相互作用（图1 d）。总之，通过分子对接可有助于我们更好地理解化合物的作用机制。
为分析化合物的ADMET性质，采用BIOVIA Discovery Studio对化合物的ADMET性质进行了预测。结果表明（表2），除了化合物22b外，其他化合物都具有非常低的血脑屏障（BBB）渗透水平。因此，预计此类化合物对CNS是安全的。化合物居于良好或者中等水平的吸收水平，但具有低或非常低的水溶性。被预测的化合物均为非CYP2D6抑制剂，因此这些化合物不会出现肝功能障碍副作用，并且大多数化合物结合血浆蛋白超过90%以上。
表2 化合物ADMET预测的结果
三. 结论
在这项研究中，设计合成了一系列新型VEGFR-2抑制剂，并评估了它们对肝癌细胞(HepG-2)细胞系的抗增殖活性，发现化合物29b抗增殖活性较好。为了进一步了解化合物对癌细胞生长抑制的影响，研究了其对细胞周期分布和凋亡诱导的影响。结果表明，29b在G2/M期诱导细胞凋亡并阻止细胞周期生长。此外，体内抗肿瘤实验表明，化合物29b和29c具有显著的抑制肿瘤生长作用。通过分子对接研究了化合物29b、29c和29a对VEGFR-2蛋白的作用机制，并通过分子模拟的方法预测了化合物的ADMET的性质。因此，这些研究结果可为我们更好地研究出高效、结构新颖的VEGFR-2抑制剂提供了一定的理论指导。
图2 预期的ADMET研究
为什么选择 BIOVIA Discovery Studio？
1. BIOVIA Discovery Studio 中共有三种对接程序，这三种对接算法各有优势，能够满足广大科研工作者的多种应用需求；
2. BIOVIA Discovery Studio 中有多种对接结果的评价分析手段，包括2D/3D相互作用图分析（可以分析氢键、疏水作用、卤键等多种非键相互作用类型）、结合口袋表面分析、氢键热图、多种打分函数、结合能的计算等；
3. BIOVIA Discovery Studio 应用广泛，操作简便，图形化界面十分友好，结果易于分析。
