酶工程 - 基于理性设计方法提高甲基对硫磷水解酶的酸稳定性研究

时间:2014-06-05

同源建模(Homology Modeling方法在众多蛋白结构预测方法当中使用最为广泛且准确性较高。只要给出目标序列与模板蛋白,利用工业标准的快速同源建模方法,便可自动并快速产生优化的蛋白同源模型, 从而极大的方便广大生物大分子研究者及药物研发人员快速了解蛋白结构。Discovery Studio中的MODELER模块是经典的同源建模工具,可以自动完成球蛋白、跨膜蛋白和抗体分子的模建,此外还可以模拟蛋白突变。

构建突变体(Build Mutant: Discovery Studio中的Build Mutants模块可以快速的构建单点或者多点突变的突变体结构,并优化突变氨基酸及周围氨基酸的结构,最后用DOPE Score评估突变体结构的合理性,方便进行快捷的选择。

蛋白表面静电势(Electrostatic Potential计算方法可以分析蛋白表面静电势,间接分析分子间静电相互作用,或分析突变蛋白的静电势变化情况等。Discovery Studio中的Delphi模块是经典而强大的分子静电分析工具,可以快速计算得到蛋白静电势表面,便于直观分析蛋白表面的电荷分布情况。

 

基于理性设计方法提高甲基对硫磷水解酶的酸稳定性研究

(Improving the acidic stability of a methyl parathion hydrolase by changing basic residues to acidic residues

RefBiotechnol Lett (2012) 34:1115–1121

链接:http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs10529-012-0882-y

 

      有机磷水解酶(OPH)对有机磷农药污染的净化和生物修复起到重要的作用。从苍白杆菌中提取出的甲基对硫磷水解酶(Ochr-MPH)可以高效降解甲基对硫磷,且在碱性环境下有很好的稳定性,然而在酸性环境下稳定性则不好。该特点也限制了该酶的应用,因此,通过蛋白质工程技术提高其酸稳性是非常有必要的。

      本文通过将蛋白表面的碱性氨基酸替换为酸性氨基酸来降低pI值从而提高Ochr-MPH的酸稳性。文章首先通过实验等方法确定了三个突变型Ochr-MPH(K208E,K277D,K208E/K277D),其在pH5.0下的半衰期都比野生型有所提高(图三),然后采用分子模拟方法进行机理解释。在模拟部分,本文基于Discovery Studio2.5.5,采用DS Build Homology ModelsDS Build Mutants先构建了Ochr-MPH野生型和突变体的三维结构模型,在结构基础上采用DS Calculate Protein Ionization and Residue pK计算在不同pH值下野生型和突变型Ochr-MPH的质子化状态并基于DS Minimization进行能量优化,然后采用DS Calculate Energy计算势能值(图二)。势能值是评价蛋白结构稳定性的最好的标准之一,势能值越低,就标志着蛋白的结构越稳定。从图二中我们可以看出,在pH值为5到6时,突变型的势能值明显低于野生型,说明在这样的pH值条件下,突变型更加稳定,也就说明对酸的耐受性更强。而这是由于在低pH值的条件下,酸性氨基酸数目的增多能够代偿这种质子化程度的提高,降低蛋白表面的静电势,从而降低了蛋白的势能,也就使蛋白的结构变得稳定。本文还采用DS Electrostatic Potential计算了蛋白的静电势表面(图一),突变型在突变位点处表面静电势都发生了改变,由正电势变成负电势,这也提高了蛋白对酸性环境的抗性。

 

图一:野生型和突变体(a MPH, b K208E, c K277D, d K208E/K277D)表面电荷分布

 

图二:野生型和突变体 (K208E, K277D, K208E/K277D)在不同pH条件下的势能

 

图三:野生型和突变体 (K208E, K277D, K208E/K277D)在 pH 5.0 (a) 和 6.0 (b)下的半衰期

 

为什么选择Discovery Studio

1. Discovery Studio在酶工程和酶催化研究领域可以提供一系列完整的解决方案,包括酶结构的构建、酶与底物作用机制的研究、酶对底物的筛选、酶的改造与设计以提高酶的活性/稳定性或改变底物/辅酶特异性等等,配合舒适的界面窗口,用户可以非常便捷的去完成这一系列的工作;
2. Discovery Studio可以进行蛋白表面静电势的快速分析,采用工具为经典的Delphi程序,可以考虑分子的溶剂效应;
3. Discovery Studio提供一整套同源建模的工具,使用DS,可以轻松完成所有的同源建模过程,包括模板识别、序列比对、自动建模、模型的评估与优化;
4. Discovery Studio中同源建模工具可以预测多种类型生物大分子的结构,包括:球蛋白、抗体、跨膜蛋白等;
5. Discovery Studio中同源建模的核心程序是MODELER,该算法非常经典,目前已发表成百上千的学术文章,学术结果遍布各类杂志,引用率极高;
6. Discovery Studio可以快速的构建单点或者多点突变的突变体结构,可以进行虚拟的丙氨酸扫描和饱和突变,并优化突变氨基酸及周围氨基酸的结构,最后用DOPE Score评估突变体结构的合理性,方便进行快捷的选择;
7. Discovery Studio提供基于虚拟氨基酸突变来进行蛋白质设计的工具,可以快速高效的进行虚拟的丙氨酸扫描和饱和突变,或者其它任意突变,并在考虑温度、pH的条件下预测蛋白热稳性及蛋白亲和力这两种突变效应,方便用户在实验前测试大量的突变位点并优先选择突变位点,是强有力的蛋白质设计工具;
8. Discovery Studio中虚拟氨基酸突变可以同时考虑单点、双点、三点或多点突变;
9. Discovery Studio中虚拟氨基酸突变功能的最终结果以突变能量柱来显示,方便用户快速直观了解不同突变位点的突变效应强与弱;
10. Discovery Studio应用广泛,操作简便,图形化界面十分友好,结果易于分析。

 

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